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檢測細胞凋亡:DNA ladder法

更新時間:2012-10-10 點擊量:3005

      發生細胞凋亡時,內源性核酸酶被激活,染色體DNA鏈在核小體之間被切割,形成180~200個堿基或其整數倍的DNA的片段,將這些DNA的片段抽提出來進行電泳,可得到DNA梯狀條帶(DNA ladder)。

一、材料與試劑

凋亡細胞

蛋白酶K(500μg/ml)

8mol/L 醋酸鉀

白細胞裂解液:pH8.0,10mmol/L Tris-HCl,10mmol/L NaCl,10mmol/L EDTA,1% SDS。

氯仿

無水乙醇,70%乙醇;

2%瓊脂糖凝膠。

二、操作步驟

1. 收集凋亡細胞:取1~2×106 個細胞,離心后,立即用70%酒精(-20℃)固定2h;

2. 洗滌:取出酒精固定的細胞,1000r/min離心5min ,去掉上清液,PBS洗二次;

3. 裂解細胞:加400μl細胞裂解液,充分混勻再加蛋白酶K100μl,置65℃水浴消化2小時或過夜;

4. 蛋白處理:加75μl 8mol/L的醋酸鉀,4℃15min,再加750μl氯仿,充分混勻后,10000r/min離心10分鐘后,將上清移至一新的Eppendorf管中;

5. 沉淀DNA:加入750μl無水乙醇,上下輕柔顛倒混合,即可見乳白色沉淀,若不明顯時可置-20℃過夜,12000r/min離心10分鐘,去上清;

6. 洗滌DNA:加1ml70%乙醇,混勻,10000r/min 離心5min,去上清;

7. 溶解DNA:根據 DAN 沉淀的大小,加一定量的蒸餾水或TE,37℃溶解;

8. 測定DNA濃度;

9. 2%瓊脂糖凝膠電泳80V 2小時;

三、結果判斷

出現梯狀電泳條帶,zui小的條帶為180~200 bp,其他的條帶為其整倍數大小。壞死細胞則出現彌散的電泳條帶,無清晰可見的條帶。正常細胞DNA基因條帶因分子量大,遷移距離短,故停留在加樣孔附近。

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