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激情盛夏,ELISA法檢測AB含量的方法

更新時間:2018-07-23 點擊量:1995

   ELISA),先將ABA蛋白質復合物與固相載體(聚苯乙烯微量滴定板)結合,然后將待測的ABA(樣品或標準品)和兔抗ABA抗體加入微量滴定板的孔中,進行競爭反應,接著棄去上清液,洗滌固相表面,加入酶標二抗使其與結合在固相ABA上的抗體反應,后去除多余的未反應的酶標二抗,測定與固相結合的酶活性,酶活性和待測ABA含量呈負函數關系,即固相ABA結合的抗體與酶標二抗量(OD或B%)隨待測ABA含量增加而減少,以一系列已知濃度的ABA的OD值制圖而獲得標準競爭性抑制曲線,對于未知樣品B,只要在同樣條件下測定反應后的OD值,就可以從標準曲線上查到ABA的量。

  測定方法 ELISA方法是一種固相抗原型酶聯免疫法(enzyme Linked Immuno Sorbent Assay 

1.包被:在微量滴定板內準確加入100μLABA包被液,37℃濕盒過夜。 

2.標樣稀釋?:取8支試管每管加150μLDB,管中加入50μL(2000ng/50μL)標準液,充分渦旋后,取50μL至第二號管中,同樣渦旋后,取50μL到第三管;依次稀釋到第六管,稀釋后的標準ABA依次為1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng/50μL。 

3. 洗板:從37℃濕盒中取出滴定板,恢復到室溫后,棄去包被液,用WB(洗滌緩沖液)洗滌三次,甩干(吸水紙)。 

4.加樣:1~8孔對應加入ABA標樣50μL,10號孔相應加入濃ABA標樣,9號孔加50μLDB,三排重復;然后每孔加50μL抗體,37℃ 45分鐘。 

5.洗板: 

6.加酶標二抗:每孔加100μL,37℃反應1小時。 

7.洗板: 

8.顯色:各孔加10μLOPD顯色液,37℃ 20分鐘。 

9.終止反應:各孔加50μL 6NH2SO4。 

10.讀數:490nm讀取OD值。其中10號孔調零,而9號孔為大值(B0),1~8號孔的OD值為B。 

11.結果計算:以In(B/B0)∕(1-B/B0)為縱坐標,以標準ABA濃度的常用對數(lg[ABA])為橫坐標,繪制曲線。

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